肝细胞癌动物模型

肝恶性肿瘤是一个全球性的健康威胁，据估计，至2025年每年发病人数将超过100万例。

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是最常见的肝恶性肿瘤类型，约占总病例数的90%，是全球第6大常见癌症和第3大癌症死亡原因，乙型肝炎病毒(HBV)感染是HCC发生发展的主要风险因素，约占总病例数的50%。

早期肝癌的五年存活率约为50.0~70.0%，中晚期肝癌五年存活率约为3.0~5.0%。

60%~70%的早期肝癌患者可能在五年内复发，复发可能发生在肝切除两个月内，大部分发生在切除后一到两年。

中国肝癌患者数量占比将近世界肝癌患者人数的一半，并且中国80%的肝癌病例查出即晚期。

2020年，中国HCC死亡患者数达到33.1万。2025年，死亡人数将以2.1%的年复合增长率增加至36.7万。2025年到2030年，年复合增长率为1.8%，至2030年，死亡人数将超过40万人。

庞大的患者数量使得中国成为全球最大的肝癌药物市场之一。

中国肝癌药物市场以23.7%的年复合增长率从2016年的30.5亿元增长至2020年的71.5亿元。

随着创新药物不断获批，中国肝癌市场预计将在2025年达到252.8亿元，并在2030年达到452.1亿元，市场潜力较大。

肝癌动物模型可分为：自发型动物模型、诱发型动物模型、移植型动物模型、基因修饰型动物模型和人源化动物模型。

一、自发型动物模型

是指模型动物在人工创造的环境条件下，无人工干预自然发病形成的疾病模型，疾病的发生发展与人类肝癌相似，适合用于研究肝癌的病因及发病机制。

优点：排除了人为因素的干扰，较好反映自然条件下肝癌的易感性程度、致癌环境因素及促癌物质的积累程度，类似于临床上的人类肝癌。

缺点：建模成功率低且不稳定，时间长，模型动物个体差异大（性别、体质量、肿瘤发生时间、肿瘤大小、肿瘤部位等），实验数量少、实验设计困难，实验重复性差，结果难以预测。

小结：实际应用价值不大，一般很少采用。

二、诱发型动物模型

利用单一或联合应用多种化学药物、生物毒素等直接或间接作用于动物的肝脏，产生慢性炎症反应，使之在数月内发生肝癌。

诱导方法：饮食、灌胃、吸入气体、腹腔注射或皮下注射等。

建模动物：小鼠、大鼠等。

优点：操作简单，癌变率高且易于操控，可模拟人类肝癌的发生发展过程，即由肝纤维化、脂肪变性、肝炎、肝硬化到肝癌的过程。

缺点：诱发过程中肝癌起病隐匿，建模周期长，病死率高，肝癌出现的时间、部位、病灶数等在个体之间表现不均一，肿瘤遗传背景未知等。

小结：现阶段常用的肝癌动物模型。

根据其作用机制，将诱导剂分为遗传毒性致癌物和非遗传毒性致癌物。

①遗传毒性致癌物

遗传毒性致癌物通过形成共价键直接与DNA相互作用，形成DNA-致癌物复合物，引起基因突变或DNA损伤，从而导致癌变。

常用诱导剂包括二乙基亚硝胺(diethylnitrosamine, DEN)、2-乙酰氨基芴、黄曲霉毒素B1等。

DEN诱导

DEN对肝脏作用专一，有较强的亲和力，操作简单，成功率高，价格相对便宜，故在肝癌的研究中，优于其他化学诱癌剂，是应用最广泛的一种诱发肝癌的化学诱导剂。

原理：DEN对肝脏有特定的毒性，使肝细胞大面积坏死，最终诱导肝癌的发生。

特点：(1)操作方便，多采用注射器腹腔注射的形式给药；(2)诱癌成功率高，小剂量、多次给药便可诱发肝癌；(3)对啮齿类动物诱导肝脏病变具有稳定性，可模拟肝损伤-肝炎-肝硬化-肝癌的发生过程。

DEN诱导的肝癌模型所需的时间依赖的因素包括给药剂量、给药频率、性别、年龄、小鼠品系、肿瘤微环境、免疫状态等。

经典小鼠模型：对2周龄的小鼠给予单次腹腔内注射DEN(1.25~25mg/kg体质量，可导致小鼠在8~12个月左右发生肝癌。但单次注射DEN诱导没有出现纤维化和肝硬化特征，解决方案：①单次注射DEN联合CCl4重复给药；②DEN长期注射。

造模方案①：用C57BL/6雄性小鼠[6~10周，(22±2)g]，每周0.014%的DEN灌胃6d，第7天正常饮水间隔1d，持续15周，第16周检测小鼠全部造模成功。

造模方案②：用DEN联合２-乙酰氨基芴的方式对雄性SD大鼠进行肝癌造模，经过15周的造模周期，通过组织病理学检查、肝损伤标志物及AFP等指标证实造模成功。

②非遗传毒性致癌物

四氯化碳(CCl₄)、硫代乙酰胺(thioacetamide, TAA)、苯巴比妥等非遗传毒性致癌物与DNA没有直接的相互作用，它们通过破坏细胞结构和改变细胞增殖来引起肝脏组织损伤，从而导致炎症、肝纤维化和肝癌的发生。

CCl4诱导

CCl₄是一种肝脏的毒性物质。

原理：通过反复急性肝损伤、炎症和修复导致纤维化，最终诱导产生肝癌。

特点：(1)腹腔注射的浓度与频率会影响其作用部位及毒性，高浓度的CCl4首先损伤的是中枢神经系统，其次再累及肝、肾；而低浓度长期注射则主要损伤肝、肾功能；(2)模型稳定性高，可重复性好；(3)乙醇可以促进CCl4的吸收，加重中毒症状，所以目前大多选用CCl4与DEN和/或乙醇联合使用诱导肝癌发生，来减少造模周期，提高造模稳定性。

造模方案：在小鼠体内用CCl4和乙醇联合诱导7周后，肝脏炎症反应强烈，伴有明显的肝纤维化和中度脂肪变性。停止注射CCl4后模型动物具有自愈性，因此在造模过程中不能间断CCl4刺激。

其他诱导

TAA是一种化学致癌物，TAA进入机体内可引起肝细胞坏死和肝纤维化，同时易产生肠源性内毒素血症，使肝脏功能进一步恶化，最终导致肝癌的发生。造模方案：用TAA诱导雄性SD大鼠16周，构建肝癌大鼠模型。

苯巴比妥与二甲氨基偶氮苯作为一种肝脏致癌物，联合使用也可以诱发肝癌。造模方案：用苯巴比妥联合二甲氨基偶氮苯对大鼠进行长期喂食，在第120天时处死大鼠，检测肝脏组织，发现大鼠全部发生肝癌。

三、移植型动物模型

是指将动物或人体内的肝癌细胞或肝癌组织移植到实验动物体内而建立的模型。

优点：肿瘤细胞的增长速度高度一致，也可以根据实验目的去控制肿瘤的位置和大小，实验动物的个体差异很小，接种的存活率高，并且试验周期通常比较短，试验条件易于控制，便于对疗效进行客观的判断。

根据肿瘤来源不同分为同种移植和异种移植，根据移植部位不同分为原位移植和异位移植。

①同种移植模型

即同一种属之间瘤株移植种植。

分为(1)自体移植；(2)同种同基因移植（同卵孪生或近交系动物之间的移植）；(3)同种异基因移植（同一物种内，遗传结构不同的个体之间的移植）。

通过异位或原位注射的方法将小鼠肝癌细胞系或小鼠肝癌组织移植到近交系具有相同遗传背景的免疫功能正常的小鼠中，该模型能够保留宿主的正常免疫功能。

一项研究将转染程序性死亡受体-配体1(programmed cell death-ligand1, PD-L1)的小鼠肝癌细胞用原位同源移植的方法注射到免疫功能正常的小鼠肝脏中成功建立了肝癌同种移植模型，用于研究抗PD-1治疗期间T细胞功能的改变。

肝癌的同源小鼠原位模型还可用于研究肝癌中复杂的肿瘤-宿主间的相互作用。

然而，小鼠和人类在基因组、免疫反应和肿瘤微环境方面存在差异，发生在小鼠肝癌中的突变可能与人原发性肝癌中的突变无关，难以将小鼠肝癌的免疫反应及免疫治疗药物运用于临床。

②异种移植模型

通过异位或原位移植的方法将培养的人肝癌细胞系或人肝癌组织植入免疫缺陷的小鼠中来构建动物模型。

优点：使用携带人类遗传物质的人类肿瘤组织或肿瘤细胞进行研究，更能代表人类肝癌的遗传异质性。

缺点：异种移植的动物存在免疫缺陷，不能反映肿瘤免疫监视的动态过程；免疫功能低下的小鼠缺乏免疫系统的主要成分，不能完全模仿人类肝癌的抗肿瘤免疫反应。

为了研究癌症免疫疗法，重现人体免疫系统的复杂性，实现这一目标的一种策略就是使用人源化小鼠模型。

其中患者来源的肿瘤组织是异种移植模型的首选，患者来源的异种移植物模型(patient-derived xenografts, PDX)保留了人类癌症的组织学、分子和遗传特征。

PDX模型可以模拟人类原发性肝癌的肿瘤微环境，患者原发性肝癌活检组织的病理组织学、分子和遗传学特征在PDX模型中完好保留，能够预测肝癌患者对治疗的反应。

③原位移植模型

即把荷瘤生物的肿瘤细胞或组织移植到动物模型的肝脏内。

优点：可在体内模拟肿瘤生长微环境，特别是肝脏微血管的形成以及免疫细胞和肿瘤的相互作用，能模拟人类肝癌的发生、发展、扩散、侵袭转移等过程。用于筛选抗癌药物，易于判断疗效。可根据实验需要，对不同种类、不同部位进行特定移植。

缺点：操作难度大、技术要求高、难以测量肿瘤大小和监测肿瘤进展、监测肿瘤生长需要腹部成像等。

应用：用于研究肝癌远处转移的机制、肿瘤与宿主的相互作用以及免疫治疗的效果等。

④异位移植模型

即把荷瘤生物的肿瘤细胞或组织移植于模型动物的腋窝、背部皮下等部位。

优点：成瘤时间快、造模周期短、瘤体观察方便，常用于筛选抗癌新药。

缺点：没有体现细胞微环境对肝癌发生发展的影响，治疗结果可能有偏差。

分为皮下移植、静脉移植、脾脏移植、腹腔移植等。

皮下移植：具有操作简单、成功率高、术中死亡率低、可重复性高、便于观察肿瘤的生长情况、准确测量肿瘤大小的优点，用于抗癌药物的筛选。例如在免疫功能正常的小鼠侧腹壁皮下注射小鼠肝癌细胞系HCa-1成功构建肝癌动物模型，证明了放射治疗和免疫检查点阻断剂之间的协同抗肿瘤作用。一般小鼠肝癌细胞皮下移植模型主要用于评价新药的抗肿瘤作用。

静脉移植：通过小鼠尾静脉注射肿瘤细胞，可模拟肿瘤的血行转移过程，可观察肿瘤的侵袭转移能力，但是操作困难、成功率低，所以很少采用。

四、基因修饰型动物模型

指把非自身的诱癌或致癌基因通过生信技术导入或整合到实验动物模型的基因染色体中并发挥功能的一类动物模型，通过基因编辑技术激活/过表达癌基因或灭活/去除抑癌基因，从而诱导肿瘤形成。

转基因模型可用于阐明肿瘤发生进展、治疗反应和先天耐药性的机制。

过表达癌基因可以使用SB转座子系统与流体动力学尾静脉注射系统(hydrodynamic tail vein injection, HTVI)一起将癌基因整合到小鼠基因组中，以使其构成过表达并随后诱导肝癌的发生。

CRISPR-Cas9系统由规律间隔成簇短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)和相关蛋白9(associated protein 9, Cas9)共同组成。是一种由RNA指导的Cas9核酸酶对靶向基因进行编辑的技术，可用于特异性基因的敲除，通过HTVI能够将CRISPR-Cas9系统编码的DNA质粒递送到小鼠肝脏，以精确地敲除肿瘤抑制基因并诱导肝癌的形成，有肝癌发病率高，动物模型稳定的优点，是目前动物模型的研究热点。

特定位点的重组酶系统(causes recombinationlocus of X-over P1, Cre-loxP)是一种强大的特异性基因敲除工具，Cre重组酶与限制酶相似，能够特异性识别loxP位点，可使某一基因在特定器官或组织以及特定的时段中被剔除，可减轻由于在全体细胞中敲除产生的副作用，利用HTVI传递Cre重组酶，可以在小鼠肝脏中实现Cre-loxP介导的条件性敲除。

构建模型的动物包括小鼠、斑马鱼等。

①斑马鱼转基因模型

优点：生命周期短、成本低、体积小、后代繁殖数量多、肝脏再生能力强、基因序列与人类基因序列高度相似等，允许进行大样本的实验研究，可以方便快捷地建立转基因动物模型。

透明的斑马鱼携带荧光蛋白，可以进行实时可视化研究，直接观察肿瘤的发生、发展和消退过程，研究人员能够观察和追踪特定细胞，并对基因表达进行分析；与啮齿动物相比，斑马鱼模型的另一个巨大优势是能够进行高通量的体内化学药物的筛选，例如用于新药发现或临床前药物筛选。

缺点：斑马鱼的肝脏非常小，在转录组学或蛋白质印迹进行分析的组织量较少，可能导致某些蛋白检测不足。

②小鼠转基因模型

优点：已知的特异性基因突变，通过转基因模型可以深入了解特定蛋白质和信号通路在肝癌发生中的作用，还可以用于验证候选癌基因和药物靶点，对于抗肝癌分子靶向药物的筛选尤为重要。肝癌可在免疫功能正常的肿瘤微环境中自然产生，有助于了解动物模型的肿瘤微环境对肿瘤的影响。

缺点：成本高、耗时长、区域或组织特异性不高，没有纤维化/肝硬化的发展过程。

人类和小鼠肝癌的遗传特征不同，只有一部分转基因小鼠模型再现了人类肝癌的基因表达谱，通过比较人类和小鼠肝癌的基因表达谱可以有效地确定合适的转基因模型来研究人类肝癌的某些亚型，例如c-Myc原癌基因/转化生长因子转基因小鼠模型的基因表达谱与人类肝癌低分化亚型的基因表达谱极为相似。

总结：在转基因动物模型中，肝癌通常在特定的肝脏微环境中自发产生，具有完整的免疫系统，是移植型动物模型的有效替代方案，可用于抗肿瘤免疫反应的研究，但是该模型没有纤维化和肝硬化的背景，需要在结合慢性肝损伤的基础上建立转基因动物模型才更加完善。

五、人源化动物模型

具有人源化免疫系统的小鼠，是一种既包含人类正常免疫系统又包含人类肿瘤组织的动物模型，可再现复杂的人体免疫系统并模拟更真实的肿瘤微环境，可用于评估免疫治疗药物的疗效和安全性。

造模方案：

将人的CD34+造血干细胞(hematopoietic stem cells, HSC)、外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)或免疫器官移植到重度免疫缺陷小鼠(NPG小鼠)体内，即把小鼠的免疫系统人源化，获得具有人源化造血/免疫系统的小鼠，然后将人类肿瘤组织或人类肿瘤细胞移植到该小鼠体内即可获得人源化小鼠模型。

应用：用于研究免疫系统与肿瘤之间的相互作用、免疫疗法在抗肿瘤中的作用、揭示免疫治疗耐受和副作用的潜在机制等。

有学者通过人源化小鼠模型的建立证明了免疫检查点抑制剂帕博利珠单抗和伊匹单抗的抗肿瘤效果和副作用。

局限性：

免疫细胞与肿瘤之间的主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)不相容性，残留的小鼠先天免疫细胞以及特异性细胞因子的缺乏等。

PBMC模型的免疫细胞对受体小鼠产生免疫攻击，会发生移植物抗宿主病(graft versus-host disease, GVHD)，并在几周后导致小鼠死亡，因此，PBMC模型仅适用于短期研究。

人类CD34+ HSC移植模型的B细胞成熟通路发育受阻，将会产生不完全成熟的B细胞进而B细胞不能产生足够的抗体，人源T细胞在小鼠胸腺上发育受到小鼠MHC的限制，T细胞无法针对某些肿瘤特异性抗原进行反应。