帕金森病动物模型

MPTP模型

MPTP是一种亲脂性化合物，可以穿越血-脑屏障(blood-brain barrier, BBB)，一旦进入大脑，会被单胺氧化酶B(monoamine oxidase B, MAO-B)代谢为强效的多巴胺能神经毒素MPP+，多巴胺转运体主动将MPP+摄取到多巴胺能神经元的线粒体内，使线粒体复合物的活性受到抑制，从而导致多巴胺能神经元变性、死亡。

MPTP病变模型总体上具有显著的运用价值，其优点在于它对黑质致密部和纹状体均有较强的敏感性，可以应用于PD发病过程中线粒体复合物活性受到抑制等相关方面的研究；并且MPTP诱导的PD动物模型能够较为准确地模拟出PD病人的运动障碍症状。

然而，MPTP方法并没有完全复制动物的PD病理。MPTP动物模型不能复制PD的多系统病理，也不能形成细胞内的蛋白质聚集体，也很难观察到路易小体的产生。用药量和方法不同均对MPTP模型的造模结果有较大影响，在小鼠中可能导致高死亡率、行为和生化结果的可变性、以及小鼠自身能过对MPTP造成的病理损害进行一定的自发修复。

MPTP猴模型

非人类灵长动物(non-human primates, NHP)在提供对疾病机制的重要见解方面发挥了关键作用，因为NHP与人类的遗传和生理密切相关。

通常多用猕猴、食蟹猴等，在血管造影下注入MPTP的介入法和分离颈动脉分叉部，夹闭颈外动脉，穿刺颈总动脉注药的手术方法，可制作猴偏侧PD模型。

MPTP损伤的猴子在基于电路调制的新的对症治疗方法中起着至关重要的作用。

NHP帕金森病症状可通过给药神经毒素或携带异常基因的病毒载体产生。

表型的严重程度可以通过一个统一的帕金森病评定量表(UPDRS)来测量，但是对NHP的评估还没有标准化。

NHP模型表现出像人类一样的症状，例如猕猴表现出左旋多巴引起的运动障碍，类似于人类的舞蹈肌张力障碍。

可以通过塔式跳跃实验和沙漏实验评估NHP的运动障碍和轴向刚度。

与啮齿动物相比，猕猴更好地复制人类的睡眠模式，这使得它成为研究睡眠或社会行为相关症状的优越模型。

由于NHP的研究需要大量的劳动力和费用以及面临伦理考验，一般仅用于临床前评估治疗。

MPTP小鼠模型

与灵长类动物相比，啮齿类动物具有价格便宜、易于控制等特点，小鼠模型适合于研究MPTP的毒性机制及神经保护性药物的研发，目前MPTP小鼠模型已经被广泛用于帕金森病的实验治疗。

根据研究目的不同，MPTP小鼠模型的制备方式分为4种：

(1)症状前帕金森病模型：小剂量MPTP(10～20mg/kg)，一次腹腔注射，适合研究代偿机制；

(2)急性帕金森病模型，20mg/kg的MPTP间断腹腔注射4次，每间隔2h，导致细胞快速坏死；

(3)亚急性帕金森模型，20～30mg/kg的MPTP注射，1次/天，连续5d，导致缓慢的细胞凋亡；

(4)慢性帕金森病模型，MPTP剂量为4mg/kg，1次/天，连续20d。

MPTP损伤的模型小鼠在急性中毒期表现出瞳孔散大、竖毛、唾液过多及阵挛性的癫痫发作等症状，一般出现在注射后的15~30min内，但可很快恢复正常。

有的实验则观察不到这些行为改变，这可能与小鼠种属、年龄、药量等MPTP敏感性的不同相关。因而尽管模型小鼠有自主活动减少的症状，但很少能见到长时间典型的帕金森病运动障碍。 

6-羟多巴(6-OHDA)模型

6-OHDA是一种儿茶酚胺选择性神经毒素，能够通过多巴胺或去甲肾上腺素转运体进入神经元。

6-OHDA模型在PD研究中得到了广泛的应用，其诱导的实验动物具有一致的行为表型并且6-OHDA模型能够预测多巴胺能神经元的变性。

优点在于其能过选择性捣毁黑质多巴胺能神经元，不会影响其它的神经元，因此可有效用于研究治疗PD药物疗效。

其缺点在于6-OHDA诱导的帕金森病动物模型最主要的运动障碍表现是偏侧旋转，不能很好地模拟出PD常见的临床症状如静止性震颤、运动功能减弱、肌肉僵直及四肢拘挛等。

6-OHDA模型是造模时间短的急性损伤模型，不能表现人类帕金森病病情进展缓慢、病程长的特点。该模型也不能表现出帕金森病的一大基本病理特征：路易小体(Lewybodies)的聚集。

利用6-OHDA构建PD模型最常见的三种注射靶点是黑质、内侧前脑束(MFB)和纹状体。在MFB中注射6-OHDA是获得显著可再生的多巴胺能变性模型的首选方法，即使在很长的生存时间内，动物也几乎没有自发补偿的倾向。

该模型具有DA病变的可预测性、稳定性且病变程度严重，对于评估长期药理治疗或神经转运作用的研究特别有用。但是6-OHDA病变不模拟PD的多系统病理。

双侧6-OHDA损毁模型

造模方法为采用200~300g大鼠在麻醉后进行大脑立体定位，将6-OHDA注入双侧黑质或前脑内侧束(medial forebrain bundle, MFB)。

由于双侧注入6-OHDA不仅可以引发动物出现运动障碍症状，还会出现较为严重的吞咽障碍、渴感缺乏等症状，动物因不能进食和饮水而出现死亡率极高的现象，相对较少采用。

单侧6-OHDA损毁模型

动物及手术操作同双侧模型。根据注射药物剂量和注射位点的不同，采用立体定位将一定量的6-OHDA注射至一侧的黑质或内侧前脑束可以建立所谓“单侧”损伤的帕金森病模型，一般在注射后24h出现多巴胺神经元的变性，2~3d后出现纹状体内多巴胺含量减少，其纹状体内多巴胺含量减少了80%~90%。

是目前在研究中使用最多的动物模型之一，它可以表现出类似于人类帕金森病的病理特点，如黑质多巴胺能神经元的变性坏死、胶质细胞增生、纹状体多巴胺含量降低等，可以在同1只动物的损伤侧与非损伤侧进行相互对比；最突出的优点就是药物诱发的旋转行为检测，是评价帕金森病干预疗效的一个稳定可靠的指标。

 鱼藤酮(totenone)模型

鱼藤酮是一种天然化合物，常被用作杀虫剂。具有亲脂性，能穿透血脑屏障，作用于非多巴胺神经元，释放细胞因子和活性氧(reactive oxygen species，ROS)物质，引起多巴胺神经元凋亡或坏死；或者直接作用于多巴胺神经元内的线粒体，释放ROS，干扰多巴胺代谢，最终通过氧化应激和能量障碍，导致细胞凋亡或坏死，从而使生物体出现PD样症状。

研究者曾将极高浓度鱼藤酮通过立体定向注入神经元细胞，导致纹状体多巴胺和5-羟色胺显著减少，然而高剂量鱼藤酮对多巴胺能神经元没有特异性。

高浓度的鱼藤酮在纹状体区域引起了液化坏死。

当长期吸入较低剂量鱼藤酮时，它能够在黑纹质区选择性地诱导细胞变性。

原发性帕金森病的一个重要特征是黑质区路易小体的富集，路易小体的主要组成部分是纤维状的α-突触核蛋白(α-synuclein)，而在正常情况下，α-突触核蛋白为细胞中非纤维化的可溶性蛋白质，因此α-突触核蛋白的纤维化在帕金森病的发病中起重要作用。

研究表明，对大鼠慢性注射低剂量鱼藤酮，会引起黑质区多巴胺神经元的退化，而存活下来的黑质神经元细胞质中也出现了与路易小体极为相似的富含α-突触核蛋白的包涵物。在鱼藤酮动物模型中观察到其他PD相关特征，如运动缺陷、儿茶酚胺耗竭和黑质多巴胺细胞丢失。

它具有复制人类PD关键病理特征的能力，可以成为进行神经保护研究的有价值的工具。该模型已被用于研究褪黑素在神经保护中的作用。

与MPTP模型相比，鱼藤酮模型是研究PD病理中路易小体形成的理想模型。

但是鱼藤酮存在半衰期短、降解快的特点。

随着时间的推移，鱼藤酮模型自愈性越来越明显，因此不能很好地模拟出人类PD的慢性进程。

百草枯(paraquat, PQ)模型

百草枯(paraquat, PQ)是发展中国家农业劳动者普遍使用的一种除草剂。

其与MPP+的结构具有相似性，被认为是一种神经毒物，它可能是PD病因的环境因素之一。

百草枯在体外和体内均能诱导星形胶质细胞衰老和激活细胞衰老相关分泌表型，衰老细胞的耗竭对PQ诱导的神经病理有保护作用。

Chinta等的研究数据表明，接触某些环境毒素会促进大脑中衰老细胞的积累，这可能导致多巴胺能神经元变性。

全身注射百草枯会导致多巴胺能神经元丢失。

百草枯会损害谷胱甘肽和硫氧还蛋白的氧化还原循环，影响保护细胞免受氧化应激的功能。

研究表明，长期服用百草枯会导致慢性神经变性和多巴胺耗竭，可用于研究PD的临床前阶段。

PQ也会导致线粒体功能受损，这与人成纤维细胞的衰老诱导有关。但是，百草枯模型也存在缺陷。

国内外通常采用通过腹腔、脑内或皮下注射百草枯的方法建立小鼠、大鼠PD模型，且每次给药剂量大，用药时间短。这样的造模方式与人类的主要经口暴露于百草枯的方式不一致。

罗烘权等通过口服途径使大鼠较长时间暴露于百草枯，模拟人类接触百草枯的方式建立PD大鼠模型，该方法也具有造模所需时间较长，不具备时效性的弊端。

 脂多糖模型

革兰阴性细菌的胞壁主要成分为脂多糖，是一种细菌内毒素，脂多糖只有在细菌细胞破坏后才被释放出来。

该物质能刺激机体产生炎性反应。

有研究表明，帕金森病的发病与炎症密切相关，当致病因素引起黑质－纹状体通路发生神经炎症时小胶质细胞会产生白细胞介素、肿瘤坏死因子-α等多种炎性细胞因子，并产生氧自由基、蛋白酶等，对神经元造成毒性，导致神经元凋亡。

使用脂多糖进行造模，需通过脑内注射的方式进行，可采用脑立体定位仪，将脂多糖注入黑质、苍白球、纹状体内。

常用的模型动物为大鼠。

有研究表明，向大鼠的黑质区域单纯注射脂多糖可导致多巴胺神经元丢失50%~85%，而注入纹状体可丢失41%。注射４周后在存活的神经元中可发现α-synuclein、泛素聚集，并伴大鼠行为学障碍。

另外，也可采用微泵缓慢脑内泵入、腹腔注射等造模方式。对小鼠可采用上述方法进行造模。

 利血平模型

利血平是一种吲哚类生物碱药物，主要功能是抑制肾上腺素能神经，用于治疗高血压。

该药对交感神经末梢中的去甲肾上腺素造成影响，阻止其摄取进入囊泡，使之被单胺氧化酶降解，导致去甲肾上腺素贮存耗竭，交感神经冲动的传递受到阻碍，因而起到血管舒张、血压降低，达到减慢心率的作用。

另外，利血平具有中枢性镇静和抑制作用，利血平进入脑内可耗损中枢儿茶酚胺的贮存，因此，服用过量可导致帕金森的症状。

该药抑制脑内囊泡单胺转运体，与囊泡转运体识别位点进行不可逆的结合，导致囊内的５-羟色胺、去甲肾上腺，以及多巴胺在细胞质内降解，使单胺类神经递质含量迅速减少，最终引起静止性震颤、运动迟缓等帕金森的症状。

利血平造模可采用腹腔注射的方式，给药后大鼠会出现活动减少、肌肉僵硬、不自主震颤，以及姿势异常等表现。

在给予左旋多巴后可得到缓解，但该造模方法只能短暂模拟出帕金森病的症状，不能完全复制帕金森病的病理变化，具有一定的局限性，但仍可用于对多巴胺替代药物或激动剂的疗效研究。

 甲基苯丙胺(MA)模型

ＭＡ又名去氧麻黄碱，即冰毒，是一种苯丙胺类的中枢神经系统兴奋剂，因具有成瘾性及药物依赖性的受到严格管控。

ＭＡ的脂溶性较高，化学结构上有苯环，进入血液循环后易通过血-脑脊液屏障直接作用于脑细胞，产生毒性作用。

该药能导致多巴胺能神经末梢的多巴胺耗损，但对黑质神经元的损伤较小，若给予大剂量皮下注射，对非人类灵长类动物及啮齿类动物具有神经毒性作用。

制备方式可采用皮下注射，模型动物选择大鼠，每天１次连续给药，4~5d后可出现肢体颤抖、舔咬皮毛等表现。

也可采用10mg/kg每２小时皮下注射４次进行造模。

据文献报道，模型动物用药初期会出现活动增加，接着会出现活动减少、肢体震颤等帕金森病表现，实验检测发现，黑质、纹状体中的多巴胺含量减少，酪氨酸羟化酶活性降低，但神经元并无明显的丢失。

主要用于制备帕金森病急性损伤模型，而表现欠稳定和持久，病理检查也没有路易小体的特征性改变。

机械、物理损毁因素制备的帕金森病动物模型

MFB是大鼠黑质多巴胺能神经元传递到纹状体的主要通路，同时，该通路也是纹状体源性神经营养因子营养黑质致密部多巴胺能神经元的途径。

因此，MFB受损后会造成黑质致密部多巴胺能神经元缺乏营养因子而死亡。

Brecknell等于1995年利用线刀切断MFB造成大鼠中脑多巴胺能神经元死亡建立了机械损伤的PD模型。

这种方法定位准确，对其他脑区损伤小，且成功率高，实验成本低。同时能够造成多巴胺神经元渐进性地损伤，可以模拟PD病理变化的全过程。

因此，该方法被较多研究者使用，尤其是在研究如何预防PD以及神经元再生等领域。但是建立该模型观察的时间周期太长，且手术后不易把握损伤的程度。

由于神经毒素6-OHDA等模型的急性严重损伤特性难以表现出帕金森病病情的渐进性发展趋势。

因此，建立一种能较好地模拟SNc部位多巴胺能神经元进行性变性坏死的动物模型极为重要。在MFB损伤第18天和第19天后分别造成44%和50%多巴胺能神经元死亡。

这种机械损伤后仍有一定数量神经元存活，为研究受损黑质多巴胺能神经元的再生能力提供了一种良好的动物模型。

2000年，梁希彬等在在国内首次尝试了线刀机械损伤模型，并将其应用到电针治疗帕金森实验中。

结果显示，MFB损伤1周后开始出现APO诱导的异常旋转行为，且随周龄增加其症状加重，甚至在造模第10周这一现象仍然存在。

这一行为可能与多巴胺神经元的丢失相关。MFP切断4周后，黑质60%的多巴胺神经元发生进行性死亡，纹状体内多巴胺含量下降了40%～60%。

同时，在这种模型上可以检测到其纹状体内神经递质的失衡。

由此可见，采用可伸缩式线刀(retractable wire knife)切断MFB，造成大鼠中脑多巴胺能神经元变性死亡方法也被广泛使用。这种方法既定位准确，又能造成多巴胺能神经元渐进性的损伤。

 基因工程制备的动物模型

帕金森病的发病与基因遗传相关，通过遗传学方法可对特定的物种进行基因修饰。基因帕金森病模型的制备方法包括基因敲除及转基因技术。

常见的帕金森病致病基因包括α-synuclein、Parkin、PINK1、LRRK2、DJ-1、Glucocerebrosidase、UCHL1、synphifin、NR4A2、tau基因等，此外，Pitx3、Engrail等与多巴胺神经元功能相关的基因也参与其中。

采用基因技术制备帕金森病模型可选择小鼠、大鼠、果蝇，以及斑马鱼作为研究对象。

有研究表明，果蝇和斑马鱼的PINK1基因突变可导致部分脑区的酪氨酸羟化酶阳性神经元减少，多巴胺神经元减少。

目前较多使用的转基因动物模型是表达人α-synuclein的微包涵体，部分动物出现一定程度的运动障碍。

在新近的研究中，有研究采用在星型胶质细胞中过表达A53Tα-synuclein的转基因小鼠，发现在此模型的中脑、脑干、脊髓中均出现了广泛的炎症反应，并伴有中脑多巴胺能神经元的坏死和瘫痪等运动障碍，然而这些模型很少重现疾病的完整特征，而且往往与人类的情况有很大的不同，大多数遗传模型未能诱导多巴胺能神经元的显著丢失。

Nagoshi用果蝇构建的α-synuclein转基因PD模型具有DA神经元丢失、路易小体形成、运动功能退化等与人类相似的病理特征，且用果蝇建立PD模型，其繁殖速度快、遗传规律简单、经济成本低。

秀丽隐杆线虫也作为模式动物用于帕金森病的研究，该模式动物被广泛用于基因组、表观遗传等领域，具有重要价值。

对基因模型的评价方法包括对模型动物的行为学检测、帕金森病神经元的检测，以及黑质、纹状体免疫组织化学等检测。