组织单细胞制备

物理解离方法：常用网搓法和研磨法

适用样本类型：淋巴节、胰腺等免疫器官组织样本。

网搓法：

1、将300目尼龙网扎在无菌的小烧杯上；

2、把剪碎的组织放在网上，以眼科镊子轻轻搓组织块，边搓边加生理盐水冲洗，直到将组织搓完；

3、收集细胞悬液于离心管中，1500 rpm离心5min；

4、弃上清液，加红细胞裂解液重悬沉淀，室温作用5min，加等体积的PBS中和后，1500 rpm离心5min，弃上清，用PBS洗涤一次，再用PBS重悬，细胞计数后即可使用。

研磨法：

1、先将组织剪成1~2mm大小组织块；

2、放入组织研磨器中，转动研棒，研至匀浆；

3、加入10mL生理盐水，冲洗研磨器；

4、收获细胞悬液，并经200目尼龙网过滤，1500 rpm离心5min；

5、弃上清液，加红细胞裂解液重悬沉淀，室温作用5min，加等体积的PBS中和后，1500 rpm离心5min，弃上清，用PBS洗涤一次，再用PBS重悬，细胞计数后即可使用。

酶解法：胰蛋白酶类、胶原酶、溶菌酶、弹性蛋白酶

适用样本类型：非免疫器官组织样本。

操作步骤：

1、先将组织剪成泥状。

2、用胰蛋白酶或胶原酶消化组织块，胰蛋白酶适用千消化细胞间质较少的软组织，如胚胎、上皮、肝、肾等组织。胰蛋白酌工作浓度一般为0.1%~0.5%。对于纤维较多的组织或较硬的癌组织常用0.25%胶原酶，胶原酌对组织中胶原蛋白类结构消化作用强，它仅对细胞间质有消化作用而对上皮细胞影响不大。胶原酶常用浓度为0.1~0.3ug/mL，用大于组织量30~50倍的胰蛋白酶液或胶原酶液在37°C，摇床上消化组织，消化时间的长短依组织类型而定，一般来说，胰蛋白酶油作用20~60min，胶原酶需1~4h左右，一般还会加入DNA核酸内切酶。

3、消化完毕后，将细胞悬液通过200目孔径尼龙网过滤，以除掉未充分消化的组织；

4、已过滤的细胞悬液经1500 rpm离心5min后，弃上清液，加红细胞裂解液重悬沉淀，室温作用5min，加等体积的PBS中和后，1500 rpm离心5min，弃上清，用PBS洗涤一次，再用PBS重悬，细胞计数后即可使用。

关键点：

1. 1、处理样本时动作温和，降低细胞裂解和损失，建议采用宽口枪头缓慢吹打单细胞悬液；

2. 2、使用细胞筛去除成团细胞及较大的组织碎片；

3. 3、可使用密度梯度离心或去除碎片的试剂盒去除碎片；

4. 4、利用死细胞试剂盒分选活细胞，提高活率。