TUNEL凋亡显色

TUNEL凋亡显色法：

TUNEL（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling）法检测细胞凋亡的原理是：

当细胞发生凋亡时，DNA内切酶被激活，核小体间的基因组DNA被切断，暴露的3'-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶（Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT）加上带有生物素（Biotin）标记的dUTP即Biotin-dUTP，随后于辣根过氧化物酶（HRP）标记的streptavidin结合，在HRP的催化下通过DAB显色来显示凋亡细胞，从而可以通过普通光学显微镜检测到细胞凋亡。

实验意义：

1、TUNEL法是一种分子生物学与形态学相结合的研究方法，可对完整的单个凋亡细胞或者凋亡小体进行原位染色，可以准确反映细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征。

2、可用于石蜡切片、冰冻切片、培养的细胞等进行细胞凋亡检测，灵敏度远比一般的组织化学和生物化学方法要高。

3、操作简便快捷，在细胞凋亡的研究中被广泛采用。

实验步骤：

1、石蜡切片TUNEL显色法：

（1）石蜡切片常规脱蜡至水，脱蜡剂二甲苯，至水剂乙醇；

（2）PBS漂洗3×5 min；

（3）加入蛋白酶K工作液37℃反应15~30 min, PBS漂洗3×5 min；

（4）4%多聚甲醛（pH 7.4的PBS）室温固定15-30 min，PBS漂洗3×5 min；

（5）浸入封闭液（3% H₂O₂）室温封闭10 min，PBS漂洗3×5 min；

（6）加入适量TdT酶反应液，暗湿盒中37℃反应1 h，用SSC室温15 min终止反应后，PBS漂洗3×5 min；

（7）浸入0.3% H2O2封闭内源性过氧化物酶活性，室温孵育3-5 min，PBS漂洗3×5 min；

（8）滴加Streptavidin-HRP工作液，37℃反应30~60 min，PBS漂洗3×5 min；

（9）滴加DAB显色液后用去离子水漂洗数次；

（10）选择是否用DAPI复染细胞核；

（11）脱水、透明、中性树胶封片后进行观察。

2、冰冻切片TUNEL显色法：

（1）新鲜组织经处理后，立即在恒冷冰冻切片机内切片，厚度为5~6 μm；

（2）防脱玻片，贴片，室温阴干约12 h；

（3）4%多聚甲醛（pH 7.4的PBS）室温固定10 min，PBS漂洗3×5 min；

（4）浸入封闭液（3% H2O2）室温封闭10 min，PBS漂洗3×5 min；

（5）浸入通透液（0.1% Triton X-100溶于PBS中），室温通透30 s~2 min；

（6）加入适量TdT酶反应液，暗湿盒中37℃反应1 h，用SSC室温15 min终止反应后，PBS漂洗3×5 min；

（7）浸入0.3% H2O2封闭内源性过氧化物酶活性，室温孵育3~5 min，PBS漂洗3×5 min；

（8）滴加Streptavidin-HRP工作液，37℃反应30~60 min，PBS漂洗3×5 min；

（9）滴加DAB显色液后用去离子水漂洗数次；

（10）选择是否用DAPI复染细胞核；

（11）脱水、透明、中性树胶封片后进行观察。