实时荧光定量PCR

实验意义：

荧光定量PCR（Realtime fluorescence quantitative PCR, qPCR）也称作实时荧光定量PCR。

即在PCR的扩增过程中，通过荧光的信号，对PCR的进程进行实时的定性、定量检测，最后通过标准曲线对初始模板进行定量分析的方法。

根据化学发光原理分为：

1、SYBR染料法

2、TaqMan探针法

SYBR染料法：

SYBR染料法利用SYBR GreenI分子的特点，SYBR Green I 是一种结合于所有双链DNA（dsDNA）双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。SYBR Green I 只有和双链DNA结合后才发荧光，游离的染料分子不发光，在新合成链延伸过程中SYBR Green I掺入双链中，变性时DNA双链解开，SYBR Green I 游离出来，无荧光。

在PCR反应体系中，加入过量SYBRGreen I荧光染料， SYBR Green I荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR Green I染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

SYBR染料法需要注意引物的特异性，因为非特异扩增产物和引物二具体均为dsDNA，所以SYBR染料法只能通过引物来保证特异性，SYBR染料法的优点在于简单且成本较低。

TaqMan探针法：

TaqMan探针法核心是探针分子，TaqMan探针是单链DNA，5'端偶联发光基团，3'端偶联淬灭基团，游离的完整探针是检测不到荧光信号的，发光基团发出的荧光会被淬灭基团吸收淬灭，探针被水解，发光基团和淬灭基团远离就可以检测到荧光信号。

反应开始时，模板链经热变性解链形成单链，TaqMan探针优先跟模板链退火，引物随后退火到模板上，之后进行链的延伸，延伸过程中Taq酶发挥5'-3'外切酶活性，遇到探针会从5'端逐个碱基切除探针，发光基团会跟淬灭基团分开，因此荧光检测系统可以接收到荧光信号，每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，荧光信号的累积和PCR产物形成是同步的。

TaqMan探针法的特异性除了由引物提供，更由探针分子保证，因其退火温度更高，所以TaqMan探针法特异性更好，在一个反应体系中加入多条探针，可以做多个基因同时检测。