真核表达载体构建

外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。

重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg²⁺、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。

DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。

两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。

但这种连接的效率比粘性末端的连接效率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。

T4噬菌体DNA连接酶催化DNA连接反应分为3步：

首先，T4DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶-AMP复合物；

然后，酶-AMP复合物再结合到具有5'磷酸基和3'羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；

最后，产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。

DNA重组的方法主要有粘端连接法和平端连接法，为了防止载体本身的自连，可以通过(牛小肠碱性磷酸酶)CIP处理克服。

连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下，粘性末端的氢键结合是不稳定的。

因此人们找到了一个折中温度，即12~16℃，连接12~16h(过夜)，这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。