EMSA实验

凝胶迁移实验（electrophoretic mobility shift assay, EMSA）是一种检测蛋白质和核酸序列相互结合的技术，可用于核酸与蛋白相互作用的定性和定量分析。

原理：

依据实验需要，设计标记探针、非标记探针、蛋白特异性抗体等参照物，基于DNA-蛋白质或RNA-蛋白质复合体在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）中有不同迁移率的原理，首先让蛋白质与末端标记的核酸探针结合，然后跑PAGE胶，当转录因子与特异的DNA或RNA结合后，其在PAGE中的迁移率将小于未结合核蛋白转录因子的DNA，从而检测到活化的与DNA或RNA结合的蛋白转录或调节因子，从PAGE胶的电泳结果就可以判断，该蛋白是否和特定序列结合或者该序列是否和蛋白结合。

实验步骤：

探针的标记 → 探针的纯化 → EMSA胶的配制 → EMSA结合反应 → 电泳分析

分类：

EMSA实验根据实验方案设计的不同，分为：验证型EMSA、竞争型EMSA、超迁移EMSA。

验证型EMSA：

用于验证探针是否含有可与蛋白质结合的位点。

探针与纯化蛋白混合孵育，探针与蛋白结合与否，可以直接表明探针和蛋白的互做关系。

蛋白提取液中蛋白质混杂，种类不单一，探针可能与多种蛋白结合。

因此，探针与蛋白提取液混合孵育，可以验证探针上是否含有蛋白结合位点，但是无法得知是何种蛋白与探针结合。

竞争型EMSA：

与探针序列相同，不含修饰基团的DNA片段称为冷探针。

在探针与蛋白质混合液中加入大量冷探针，冷探针含有和探针相同的DNA序列，会干扰探针与蛋白的结合。

在电泳图的相应位置处，电泳带的的信号减弱或消失。

探针和蛋白的结合未必是特异性结合，或者蛋白本身可能含有生物素，二者均能产生假阳性的实验结果。

增加一个冷探针的干扰实验，可以排除假阳性结果，增加实验结果的准确性。

超迁移EMSA：

超迁移EMSA利用到了与待检测的目的蛋白特异性结合的抗体。

如果蛋白质溶液不是单一的纯化蛋白，无论是验证型EMSA，还是竞争型EMSA，都无法证明和探针结合的蛋白质就是我们所预期的。

在实验体系中引入特异性抗体，用抗体特异性地结合蛋白-探针复合物，这就是超迁移EMSA。

蛋白-探针复合物被抗体识别并结合，该三聚复合物在凝胶电泳中，迁移速率再次增大，电泳带出现在蛋白-探针复合物的上方。

超迁移EMSA是以竞争型EMSA为基础的实验方案。

超迁移EMSA的实验结果可以很好的验证探针是否和蛋白结合，是否是特异性结合，与探针结合的蛋白是否是预期的蛋白质。

EMSA实验优点：

◆  简单快捷：相较于CHIP和RIP，EMSA具有更简单的操作步骤，更短的实验周期，约1天内可完成。

◆  结果可靠：EMSA实验能较真实的模拟蛋白质与核酸在体内互作的机制与过程。数据重复性好。

EMSA实验缺点：

◆  通量低：EMSA一次实验仅能验证少数的核酸序列信息，通量低。CHIP和RIP实验通过目标蛋白分离以及高通量测序，可以得到海量的互作核酸序列信息。

◆  结果局限：EMSA基于蛋白天然构象与核酸的某一段区域结合而发生相互作用。因此不能找到具体蛋白的何种氨基酸位点或区域，与核酸的片段相互作用。